Chromatographie

In der HPLC werden üblicherweise gepackte Säulen verwendet, die aus kugelförmigen, mikroporösen Kieselgel-Partikeln (< 5 μm) als Trägermaterial der stationären Phase bestehen. Für die weitverbreitete Umkehrphasenchromatographie (reversed-phase chromatography, RP-HPLC) ist eine Modifikation der Kieselgeloberfläche erforderlich, um eine Umkehrung der Polarität der stationären Phase zu erreichen. Durch Derivatisierung der Silanolgruppen mit Trimethylsilyl-Gruppen und anschließender Einführung von unpolaren Gruppen, wie Octadecyl oder Perfluorophenyl, kann die stationäre Phase an die Anforderungen des Trennproblems angepasst werden. Als mobile Phase werden Lösungsmittel eingesetzt, die nach ihrer Elutionskraft bzw. der Fähigkeit, den Analyten aus der stationären Phase zu verdrängen, tabellarisch in eine elutotrope Reihe eingeordnet werden. Für die RP-HPLC werden üblicherweise polare Lösungsmittel, wie Methanol, Acetonitril oder Wasser eingesetzt, während für die Normalphasen-HPLC Chloroform oder Toluol geeignet sind. Bei unzureichender Elutionskraft durch isokratische Elution mit nur einem Lösungsmittel, kann die Trennung eines Gemischs durch Anwendung einer Gradientenelution, bei der die Lösungsmittelzusammensetzung kontinuierlich geändert wird, gesteigert werden. [1,2]

Die chromatographische Trennung eines Substanzgemisches in der HPLC beruht auf dem kontinuierlichen Stoffaustausch bzw. der Verteilung zwischen der bewegten flüssigen und der stationären Phase. Substanzen, die starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase zeigen, verbleiben länger in der Säule, während Substanzen mit größer Affinität zum Lösungsmittel zuerst eluiert werden. Die Wechselwirkung wird in der RP-HPLC bei unpolaren, stationären Phasen hauptsächlich durch Van-der-Waals-Wechselwirkungen hervorgerufen, während bei polaren, stationären Phasen Dipol-Dipol-Interaktionen und Wasserstoffbrückenbindungen berücksichtigt werden müssen. [1,2]

Die Trennleistung in der HPLC ist abhängig von Faktoren, wie dem Partikeldurchmesser der stationären Phase und der Durchflussrate der mobilen Phase. Die Van-Deemter-Gleichung beschreibt den Zusammenhang zwischen der theoretischen Bodenhöhe und der linearen Fließgeschwindigkeit. Die Effizienz der Trennung wird durch zusätzliche Wege (Eddy-Diffusion), Longitudinaldiffusion und Stoffaustauschverzögerung beeinflusst. Die Beziehung führt zu einem globalen Minimum, bei dem die theoretische Bodenhöhe minimal ist und somit die optimale Trennung erreicht wird. [1,3]

Eine weit verbreitete Methode zur Detektion in der Chromatographie stellt die Massenspektrometrie dar, wobei auch UV-VIS-, Brechungsindex- und elektrochemische Detektoren zum Einsatz kommen. [1]